要求退还购物款3 大家觉得索要百万赔偿山

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由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤评估序列质量去除低质量序列和3’接头5’接头和多A序列计算小RNA长度分布[143 144]余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNAtRNAsnRNA和其他ncRNA序列剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs使用了如下法则来确定新miRNAs:碱基的数量为18到24自由能≤-20 kcal/mol并且miRNA从一个前体端产生Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA* 224 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen China)试剂盒来提取定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen China)定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology USA)定量引物使用miRprimer软件[146]设计见表2-1 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 225 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法尽管河蚬基因组和EST序列缺乏但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi hsp70 cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测 23 结果与分析 231 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜肌肉消化腺性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息过滤掉低质量的和接头序列清楚污染的和短序列后我们获得了28799934条高质量的reads这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads(表2-2)去除掉rRNA tRNA snoRNA和其他ncRNA序列剩下的4995304 reads(代表16144个 不同的reads)被用来预测保守的和潜在的新miRNAs(表2-2)不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1我们发现绝大多数是22bp占了总reads数的144%同样地在斑点叉尾(258%)[143]和珍珠贝中(3448%)[29]也是22bp的最多 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39813 100 6194289 100 rRNA 11262 2829 1048538 1693 tRNA 2124 533 22289 036 snoRNA 19 005 183 000 other 10264 2578 127975 207 miRNA 16144 4055 4995304 8064 232 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库允许有1到2个错配碱基[152]总共16144个唯一的序列被比对到数据库属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来(附录4)此外这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数miR-10测得1304866个拷贝数是最多的紧接着是miR-184(258355)miR-315(220094)和miR-7(144322)(附录2)在这些保守的miRNAs中15个只有低于100个拷贝数miR-67a和miR-67b只被检测到1次 233 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs它们二级结构的自由能从2010到9900 kcal/mol(附录3)有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝15个新miRNAs少于10个拷贝预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2 图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 234 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平特别地4个新的(Novel-2 Novel-14 Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10 miR-12 miR-67a miR-184 miR-216a miR-216b miR-1985 and miR-1992)(图2-3)miRNAs被检测了表达水平 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高此外miR-1992在所有组织中表达相似广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]相比较而言一些miRNAs高度显示了组织特异性miR-67a和miR-1985在腹足中最高接着是外套膜鳃和内脏团此外我们发现miR-12主要在腹足中表达然后依次是内脏团鳃和外套膜miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少而且miR-184和miR-10表达水平在鳃腹足和外套膜中几乎一样在内脏团中明显低而在新miRNAs中Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富在 鳃和内脏团表达量低Novel-31在腹足中表达量最高接着是外套膜和鳃而在内脏团中非常低Novel-2在鳃中很少表达但在腹足外套膜和内脏团中表达高 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中(鳃腹足内脏团外套膜)的表达水平 235 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件这款软件允许G=U假阳性这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]可以用于人老鼠苍蝇和蠕虫的序列预测[156]相比较而言RNAhybrid是一款简单快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点能计算杂交结构自由能 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用(表2-3)metallothionein基因是miR-7的目标miR-1992miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi hsp70 cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY8856671) miR-315 miR-8a miR-8b Novel-30 Novel-38 miR-277 Novel-1* Novel-4 hsp70(KJ4617381) miR-1992 miR-2a miR-2b miR-2c Novel-40 miR-1992 miR-2b miR-34 Novel-29 Novel-40 cyp4(JQ6788182) miR-10 miR-1992 miR-315 Novel-30 Novel-15 Novel-23 Novel-36 miR-10 miR-1992 miR-1994 miR-263 miR-285a miR-285b miR-34 miR-7 Novel-1* Novel-14 Novel-17 Novel-29 Novel-3 Novel-4 metallothionein (EF1851261) miR-1985 miR-315 miR-7 miR-7 miR-981 Novel-20 Novel-29 Novel-31 Novel-6a Novel-6b Novel-8 24 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据并进行了分析发现保守的miRNAs表达比较高之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]miR-10在河蚬中是表达量最高达文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达能调控Hox 转录本的翻译[160]这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达接下来是鳃和外套膜Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达仅有少数miRNAs在多组织中高度表达 河蚬新miRNAs的表达量低 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]此外25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000绝大多数测序数小于100[163]我们的结果与之前的研究是一致的[164 165]新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用 25 本章小结 在本研究中我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列鉴定了45条保守的和39条新的河蚬使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs发现它们在4个组织中表达各有差异此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础 第三章 河蚬CCKConopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 31 引言 目前人老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛牡蛎章鱼等海洋软体动物没有淡水双壳类动物的文献报道神经肽的毒理学研究也很少开发河蚬典型神经肽标志物并应用于毒理学研究十分必要本研究选取了CCKConopressin和FFamide神经肽作为研究基因 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考运用RACE技术成功克隆了CCKConopressin和FFamide神经肽基因的全长对全长序列进行了生物信息学分析使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响筛查了神经肽标志物 32 材料与方法 321实验材料 3211 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA)公司;荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT) 18、DNase I和dNTP购自Promega(USA)公司;100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物(北京中国)公司;SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA)公司,现场开奖报码室;TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit pMD20-T vector 和Ecoli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian China)公司; 三氯甲烷异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯 3212实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf USA) PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD USA) Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD USA) 梯度热循环仪(Veriti thermal cycle system)(Life TechnologiesUSA) Multiskan GO 酶标仪(Thermo ScientificUSA) 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system(Life TechnologiesUSA) 3213统计分析与绘图软件 SPSS160 软件Origin80软件 322河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集壳长在1-3cm 左右年龄在1-2龄左右带回实验室用恒温养殖系统进行驯养采用流水养殖建立一套恒温的流水系统进行养殖选用水泥池流水循环系统养殖河蚬以水泵提供流水动力建有过滤池和养殖池水经过水泵从过滤池传送到养殖池再流回过滤池进行过滤池底铺粒径为05 mm左右的细沙所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水室内温度使用空调控制水温保持在20±1oC水质硬度在250mg/L以下 光照周期为12h:12h饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料河蚬实验室养殖规范见附录1 323 RNA 提取和 cDNA 合成 3231 RNA 提取操作步骤: 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法在无菌和无RNA酶的超净工作台进行具体操作步骤如下: (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的15 ml EP管迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液然后用电动棒碾磨均匀接着加入冰预冷的800μL Trizol液注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%室温放置5min使其充分裂解 (2)以每1mlTrizol液加入02ml 的比例加入冰预冷的氯仿盖紧离心管用手剧烈摇荡离心管15 秒室温放置3 min然后放入离心机4℃12000转离心15min吸取上层水相尽量不要将沉淀吸入移至另一15mLEP管中 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀室温放置10min (4)12000 g4°C离心10 min弃上清此时RNA沉于管底 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇用手轻轻上下翻转约50次用移液器反复吸吹悬浮的沉淀 (6)8000 g4°C下离心5min尽量弃上清 (7)室温?干注意不要干燥过分然后将RNA 溶于无核酸水中利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度一般OD260/OD280>18时样品纯度符合要求其余的RNA于-80℃冻存进行反转录合成 3232 去除 RNA 中的 DNA (1)用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL) RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL (2涡旋混匀后37°C 水浴 30min (3)加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL混匀瞬时离心65°C 反应 10min (4)RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于18其余的RNA于-80℃冻存进行反转录合成 3233 cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量使用Promega 江湖少郎为大家奉上深度有价值的文章关注并为你送出多重美丽津贴: 赫安i女王第一期权利开放日 7月8日-15日 缤纷福利送不停,通天报正版图!雪姨再次火了!你是怎么看比伯和海莉订婚了!不具有任何商业用途,与催人奋进的“狼性文化”咫尺天涯,家长到店里讨说法。
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